محیط های کشت، معرفها و رنگها
ساعت ٤:٥۸ ‎ق.ظ روز جمعه ٩ امرداد ،۱۳۸۸ : توسط :

نکات مهم در تهیة   محیط های کشت

آب

l      آب مورد استفاده در محیط سازی باید دارای کیفیت مناسب باشد یعنی فاقد مواد مهار کنندة رشد میکروبی (یونهای سمی مثل مس) یا تأثیرگذار در رشد میکروبی باشد. آب شیر نامناسب است چون دارای ناخالصی های ذاتی(منیزیم، کلسیم، کلر، فلور) است.

l      آب خوب و تازه را با تقطیر یا دیونیزاسیون تهیه کنید. برای نگهداری آبمقطر از ظرفی استفاده کنید که از مواد خنثی (شیشة خنثی، پلی اتیلن) تهیه شده باشد.

l      ضریب هدایت آب باید کمتر از   15 µsباشد.

l        PHآب معمولاً کنترل نمی شود مگر آنکه در PH محیط های کشت تهیه شده، مشکلی بوجود آید

توزین پودر محیط کشت

l      در تهیة محیط کشت طبق دستورالعمل شرکت سازنده که بر روی قوطی نصب شده، مقدار مناسبی از پودر را با دقت وزن کنید.

l      ظرف محیط کشت را دور از کوران هوا و رطوبت باز کنید.

l      از استنشاق پودرها بخصوص آنهایی که دارای مواد سمی هستند و تماس طولانی مدت آنها با پوست اجتناب کنید.

l      پودر را به سرعت، به دقت و بدون ایجاد توده ای از غبار وزن کنید. هنگام کار از ماسک مناسب استفاده کنید.

l      درب قوطی محیط کشت را هر چه سریعتر ببندید.

افزودن آب

l      نصف حجم آب مورد نیاز را داخل ظرف بریزید، سپس مقدار توزین شدة محیط کشت را به آن اضافه نمایید و برای چند دقیقه به تندی تکان دهید.

l      باقیماندة آب را به دیواره های ظرف بریزید تا ذرات محیط کشت چسبیده به دیوار، وارد محلول شوند. این مرحله بسیار مهم است چون ممکن است پودر خشک محیط کشت در بالای سطح آب در اتوکلاو استریل نشود و منبع آلودگی بعدی گردد.

l      آب را در ظرف مناسب، با حجم 2 تا 3 برابر حجم نهایی محیط کشت بریزید تا بتوان آنرا بخوبی تکان داد و

حل کردن پودر محیط کشت

l      محیط های کشت فاقد آگار معمولا به راحتی در آب حل میشوند.

l      محیط های کشت حاوی آگار را باید قبل از حرارت دادن، چند دقیقه با آب مخلوط نمود، سپس حرارت داد تا آگار قبل از اتوکلاو کردن کاملاً حل شود. محیط های کشت را بجوشانید بدون آنکه بسوزند.

l      محیط های کشتی که نباید اتوکلاو شوند بعد از حل شدن آگار، برای توزیع در ظروف نهایی آماده خواهند بود اما اکثر محیطهای کشت به استریلیزاسیون نهایی دارند.

استریلیزاسیون

q     استریلیزاسیون با حرارت مرطوب:

           در اتوکلاو به مدت 15 دقیقه و در دمایC   ۫121 انجام می گیرد.

           توصیه می شود مقادیر زیاد محیط کشت را در حجم های کوچکترتقسیم نمایید.

q     استریلیزاسیون با صافی غشایی:

     استریلیزاسیون تحت شرایط خلأ یا افزایش فشار انجام می گیرد.

     برای استریلیزاسیون مواد و ترکیبات حساس به حرارت بکار میرود.

     از غشاءها و صافی های با قطر منفذ µm 22/0 یا 45/0 استفاده کنید.

     این فیلترها قبل از استفاده باید در اتوکلاو استریل شوند.

اندازه گیری و تنظیم PH

l      اگر محیط های کشت دهیدراته بطور مناسب تهیه شوند، نیازی به تنظیم  PHتوسط مصرف کننده نیست.

l      PH نهایی محصول استریل شده را می توان روی پلیت یا بطری اندازه گیری کرد، اما باید آن را پس از سنجش PH دور ریخت.

l      پس از استریل و خنک شدن محیط کشت تا دمای C ۫ 25، مقدار PH را در حد مورد نظر( 2/0 ±) تنظیم کنید.

l      تنظیم PH معمولاً با استفاده از NaOH40 گرم در لیتر و یا با استفاده از HCl 5/36 گرم در لیتر انجام می شود.

  آماده سازی جهت مصرف

l      بعد از استریلیزاسیون و پس از آنکه دمای محیط کشت به حدود C ۫ 50  رسید، با رعایت شرایط آسپتیک آنرا در ظروف نهایی استریل توزیع کنید.

l      باید مکمل های حساس به حرارت را بعد از آنکه دمای محیط کشت به حدود C ۫ 50  رسید،  در شرایط آسپتیک به آن اضافه نمود.

l      دمای مکمل (ساپلمنت) استریل  نیز باید قبل از افزودن به محیط کشت به دمای اتاق برسد.

l      جهت کنترل استریل بودن پلیتها، 5-3% آنها را برای 24 ساعت انکوبه کنید. در طول انکوباسیون ممکن است رطوبت محیط آگار از بین برود.   از دست دادن بیش از 15% محتویات آب، ممکن است روی رشد میکروارگانیسم اثر نامطلوب بگذارد.

 ذخیره سازی

l      محیط های کشت آماده شده را سریعاً مصرف نموده یا تحت شرایطی که محتویاتشان تغییر نکند یعنی دور از نور و در دمای یخچال ذخیره نمایید.

l      در صورت بسته بندی پلیتها در کیسه های پلاستیکی، زمان نگهداری آنها افزایش می یابد. برای جلوگیری از تجمع رطوبت در پلیتها، آنها را قبل از قرار دادن در کیسه، خنک کنید.

l      برای تلقیح سطحی محیط کشت جامد، سطح پلیت مربوطه را خشک کنید. برای این کار، درپوش پلیت را برداشته و هر دو را بطور واژگون در داخل انکوباتور که در دمای C ۫ 50 – 25 تنظیم شده، قرار دهید تا قطرات آب از سطح محیط کشت ناپدید شود.

خطاها و مشکلات در محیط های کشت تهیه شده و بررسی علل ممکن

رنگ یا تیرگی غیر طبیعی

l      آب ناخالص

l      ظروف شیشه ای کثیف

l      کیفیت بد محیط کشت دهیدراته

l      حرارت زیاد در طی استریلیزاسیون

l      PH نادرست

l      حل نشدن کامل محیط کشت

رگه رگه شدن

l      رگه رگة سیاه : آگار نیم سوز شده است.

l      رگه رگة روشن : وقتی مکمل ها اضافه شده اند که آگار سرد شده بوده است.

PH  نادرست

l      آب ناخالص یا ظروف شیشه ای کثیف

l      حرارت بیش از حد، ذوب مجدد یا ذخیرة طولانی محیط کشت در دمای C ۫ 50

l      آلودگی شیمیایی

l      کالیبراسیون نادرست PH متر

l      حل نشدن کامل محیط کشت

l      کیفیت بد محیط کشت دهیدراته

l      اندازه گیری PH در دمای بالای C ۫ 25

رسوب، کدورت

l      حرارت بیش از حد

l      ذخیرة طولانی (بیش از 4 ساعت) در حالت مذاب (دمای C ۫ 50)

l      کیفیت بد محیط کشت دهیدراته

l      PH نادرست

l      آب ناخالص یا ظروف شیشه ای کثیف

l      حل نشدن کامل محیط کشت

l      وقتی مکمل ها اضافه شده اند که محیط کشت خیلی داغ بوده

l      کیفیت پایین آب یا ظروف

رشد باکتریایی ضعیف یا اثر روی خواص انتخابی/ افتراقی

l      توزین/ مخلوط کردن نامناسب

l      آب، ظروف شیشه ای یا لوله ای آلوده

l      وجود مواد مهار کننده در آب یا ظروف

l      کیفیت بد محیط کشت دهیدراته

l      وقتی مکمل ها اضافه شده اند که محیط کشت خیلی داغ بوده

l      محیط هنگام کشت نمونه بر روی آن، خیلی داغ بوده

l      ذخیرة طولانی و بیش از حد خشک شدن محیط کشت

l      حل نشدن کامل محیط کشت، تغییر PH محیط کشت

l      حرارت طولانی مدت و مفرط

آگار (ژل) نیم بند

l      حرارت بیش از حد (به خصوص در PH پایین)

l      هیدرولیز اسید در آگار در محیط های کشت با PH پایین

l       توزین/ مخلوط کردن نادرست

l      حل نشدن کامل آگار

l      حجم نادرست آب، رقیق سازی زیاد با مایع تلقیح یا مکمل های محیط کشت

l      ذخیرة طولانی محیط کشت در دمای C ۫ 50

 روش تهیة محیط های کشت دهیدراته و استریلیزاسیون آنها

l      روش کار بر اساس دستورالعمل موجود بر روی قوطیهای حاوی انواع محیط های کشت می باشد.

l      روش استریلیزاسیون نیز بر روی برچسب دستورالعمل تهیة محیط کشت درج گردیده است.

l      این دستورالعمل ها بر حسب نوع محیط کشت و شرکت تولید کننده، متفاوت است.

روش تهیة محیط کشت ژلاتین

l      پپتون :  g5

l       Beef Extract: g 3

l      ژلاتین :g  120

l      آب مقطر : ml 1000

    مواد فوق را به آب مقطر اضافه کرده، در بن ماری در حال جوش قرار دهید تا کاملاً حل شوند (از حرارت مستقیم بر روی شعله بپرهیزید). PH محیط کشت را به 8/6 برسانید، سپس در لوله تقسیم کرده وبه مدت 15 دقیقه در دمای C  ۫121 استریل نمایید.

روش تهیة محیط کشت  آب پپتونة قلیایی (APW )

l      پپتون :  g10

l      کلرید سدیم :  g10

l      آب مقطر: ml 1000

PH     محیط کشت را به 9-6/8  برسانید، سپس در لوله تقسیم کرده و به مدت 15 دقیقه در دمای C  ۫121 استریل نمایید.

     برای تنظیم PH  از سود 1 نرمال استفاده کنید.

روش تهیة محیط کشت  ) NaCl 6.5%براث/ آگار )

l      محیط پایه، همان برین هارت اینفیوژن براث / یا آگار است. این محیط کشت حاوی 5/0% نمک است، بنابراین 6% نمک کلرید سدیم به این محیط پایه اضافه می شود تا مقدار نهایی 5/6% نمک حاصل شود. سپس محلول حاصل را در لوله تقسیم کرده وبه مدت 15 دقیقه در دمای C  ۫121 استریل نمایید.

روش تهیة انواع قندها

l       از قند مورد نظر، محلول 10% تهیه نمایید.

l      در صورت امکان محلول های قندی را به روش فیلتراسیون، استریل نمایید.

l      در غیر اینصورت، انواع لاکتوز، مالتوز، زایلوز، ساکاروز، ترهالوز، آرابینوز و سالیسین را در دمای C ۫121، فشار lb 15 به مدت 3 دقیقه استریل نمایید. سایر قندها را در دمای C۫ 118- 116 فشار lb 12-10 به مدت 15 دقیقه استریل نمایید.

روش تهیة معرف MR

l      پودر متیل رد : g 1/0

l      اتانول : ml 300

     پودر متیل رد را در اتانول حل کرده، با آب مقطر حجم آنرا به ml 500 برسانید.

Ø      معرف را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف های VP

v     تهیة α نفتول (معرف (A:

l       پودر α نفتول  g :5

l       اتانول : ml 100

v     تهیة KOH (معرف (B:

l      g : KOH 40

l       کراتین : g 3/0

l       آب مقطر : ml 100 

Ø       معرفها را در ظروف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف کواکس

l      - دی متیل آمینو بنزآلدئید : g10

l      ایزوآمیل الکل : ml 150

l      اسید کلریدریک غلیظ و تازه : ml 50

 P   - دی متیل آمینو بنزآلدئید را به آمیل الکل اضافه نموده و به آرامی اسید کلریدریک را به آنها اضافه نمایید.

     برای تهیة این معرف از هود استفاده نمایید.

Ø      معرف را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف کلرور فریک

v     روش غیر اسیدی :

l      کلرور فریک : g10 

l      آب مقطر : ml 100

v     روش اسیدی :

l       کلرور فریک :  g12

l      اسید کلریدریک غلیظ : ml 5/2

l      آب مقطر : ml 100

Ø      معرف را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف های نیترات

v     تهیة معرف  A:

l       N ,Nدی متیل آلفا نفتیل آمین (سرطانزا) : g 6

l      اسید استیک گلاسیال N 5 (30%) : ml 1000

      پودر  N ,N دی متیل آلفا نفتیل آمین را در کمتر از ml 1000 اسید استیک حل کرده، کمی حرارت دهید تا حل شود، حجم را به یک لیتر رسانده، محلول را از صافی رد کنید.

v     تهیة معرف  B:

l      سولفانیلیک اسید (P- آمینو بنزن سولفونیک اسید) : g 8

l      اسید استیک گلاسیال N 5 (30%) : ml 1000

     پودر سولفانیلیک اسید را در کمتر از ml 1000 اسید استیک حل کرده، سپس حجم را به یک لیتر برسانید.

Ø      معرفها را در ظروف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف نین هیدرین

l      پودر نین هیدرین :  g5/3

l      استن : ml 50

l      بوتانول : ml 50

     استن و بوتانول را مخلوط کرده و سپس پودر نین هیدرین را اضافه نمایید.

Ø      معرف را در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری کنید.

روش تهیة ویتامین K1

l      پودر ویتامین K1 :  g2/0

l      اتانول : ml 20 

    پودر ویتامین K1 را روی قطعة کوچکی از فویل آلومینیومی استریل وزن کرده و در شرایط آسپتیک به اتانول در یک بطری استریل اضافه کنید. غلظت محلول ذخیره mg/ml 10 است.

    غلظت نهایی محلول برای محیط های مایع µg/ml 1/0 و برای محیط های آگاردار µg/ml 10 است (یعنی ml 01/0 از محلول ذخیره در یک لیتر براث و ml 1 از محلول ذخیره در یک لیتر آگار). برای رقیق سازی بیشتر از آب مقطر استفاده کنید.

Ø      محلول ذخیره را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة همین (Hemine)

l      Hemine :  g5/0

l      سود 1 نرمال : ml 10  

    پودرهمین را در سود 1 نرمال حل کرده، سپس با آب مقطر به حجم ml 100 برسانید.

    به مدت 15 دقیقه در دمای C  ۫121 استریل نمایید.

    غلظت محلول ذخیره mg/ml 5 است، ولی هنگام مصرف به عنوان ساپلمنت باید دارای غلظت نهایی µg/ml 5 باشد.

Ø      محلول ذخیره را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف اکسیداز

v     معرف Kovacs : محلول بیرنگ، حساستر با سمیت کمتر

l      تترا متیل- P- فنیلن دی آمین هیدروکلراید :  g1

l      آب مقطر : ml 100

v     معرف Gordon & McLeod : محلول ارغوانی، پایدارتر

l      دی متیل- P- فنیلن دی آمین هیدروکلراید :  g1

l      آب مقطر : ml 100

     پودر مورد نظر را در کمتر از ml 100 آب مقطر حل کنید، به آرامی حرارت دهید، حجم را به ml 100 برسانید. 15 دقیقه ثابت نگه دارید.

Ø      معرف را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

روش تهیة معرف کاتالاز (3% H2O2 ,)

l      محلول آب اکسیژنة 30% را به نسبت 1:10 با آب مقطر رقیق کنید تا محلول آب اکسیژنة 3%  حاصل شود.

Ø      معرف را در ظرف تیره و در یخچال نگهداری کنید.

 روش تهیة کریستال ویوله و  اگزالات آمونیم

 v     تهیة کریستال ویولة ذخیره :

l      پودر کریستال ویوله :  g20

l      اتانول : ml 100

v     تهیة اگزالات آمونیم :

l      پودر اگزالات آمونیم :  g1       

l      آب مقطر : ml 100

     هنگام مصرف محلول کریستال ویولة ذخیره را به نسبت 10: 1 با آب مقطر رقیق کنید، سپس محلول حاصل را با 4 حجم از محلول اگزالات آمونیم رقیق کنید.

Ø      محلول ذخیره و مصرفی کریستال ویوله را در ظروف تیره و در دمای اتاق نگهداری کنید.

روش تهیة لوگل

l      ید :  g1

l      یدور پتاسیم : g 2

l      محلول آبی بیکربنات سدیم 5 % : ml 60

l      آب مقطر : ml 240

     در مقدار کمی از آب مقطر، ید و یدور پتاسیم را کاملاً حل          کرده، حجم را با آب مقطر به ml 240 برسانید. ml 60

     محلول 5 % بیکربنات سدیم را نیز به آن اضافه نمایید.

Ø       محلول را در ظرف تیره و در دمای اتاق نگهداری کنید.

روش تهیة محلول الکل- استن

l      اتانول : ml 250

l      استن : ml 250

   حجم مساوی از اتانول را با استن مخلوط نمایید.

روش تهیة فوشین یا سافرانین ذخیره

l      پودر فوشین : g 2

l      اتانول : ml  100

    و یا

l      پودر سافرانین : g5/2

l      اتانول : ml  100

     هنگام مصرف محلول ذخیرة فوشین  یا سافرانین را به نسبت10: 1   با آب مقطر رقیق کنید.

Ø      محلول های ذخیره و مصرفی را در ظروف تیره و در دمای اتاق نگهداری کنید.

 

 

 

Dr. Kiarash Ghazvini
Department for bacteriology and virology,
Mashhad University of medical Sciences

 


 
به خودآی که خودخدایی
ساعت ٥:٠٩ ‎ب.ظ روز پنجشنبه ۸ امرداد ،۱۳۸۸ : توسط :

 


 
به پرشین بلاگ خوش آمدید
ساعت ٥:٠٩ ‎ب.ظ روز پنجشنبه ۸ امرداد ،۱۳۸۸ : توسط : پرشین بلاگ
بنام خدا

كاربر گرامي

با سلام و احترام

پيوستن شما را به خانواده بزرگ وبلاگنويسان فارسي خوش آمد ميگوييم.
شما ميتوانيد براي آشنايي بيشتر با خدمات سايت به آدرس هاي زير مراجعه كنيد:

http://help.persianblog.ir براي راهنمايي و آموزش
http://news.persianblog.ir اخبار سايت براي اطلاع از
http://fans.persianblog.ir براي همكاري داوطلبانه در وبلاگستان
http://persianblog.ir/ourteam.aspx اسامي و لينك وبلاگ هاي تيم مديران سايت

در صورت بروز هر گونه مشكل در استفاده از خدمات سايت ميتوانيد با پست الكترونيكي :
support[at]persianblog.ir

و در صورت مشاهده تخلف با آدرس الكترونيكي
abuse[at]persianblog.ir
تماس حاصل فرماييد.

همچنين پيشنهاد ميكنيم با عضويت در جامعه مجازي ماي پرديس از خدمات اين سايت ارزشمند استفاده كنيد:
http://mypardis.com


با تشكر

مدير گروه سايتهاي پرشين بلاگ
مهدي بوترابي

http://ariagostar.com